Hiki i nā hoʻololiʻana i kekahi o nā māhele o kahi Hua'ōlelo o ka Chain Reaction (PCR) hiki ke hoʻololi i ka maikaʻi o ka hopena, ma o ka hoʻomaikaʻiʻana a iʻole ka ho'ēmiʻana i ka huahana hua a me ka maikaʻi a ma o ka hoʻomaikaʻiʻana i ka hōʻoia kiko'ī a me kaʻike. ʻO nā pae hoʻohālike e hopena i ka hopena hopena e hiki ke lilo i ke kino (ie, temperature, time cycle) a iʻole kelepona (ʻo ia hoʻi, ke kukū helu, keʻano o ka enzyme hoʻohanaʻia). Eia kekahi mau kumu nui e hoʻoikaika ana i ka holomua o PCR.
01 Kūlana Laboʻo Pono
No ka mea hiki i ka PCR keʻike i kahi mole mole o DNA, he mea nui e mālama i nā kūlana maikaʻi i loko o ka labo. E komo i nā mīkina lima mau i kēlā manawa, e hoʻohana i nā meaʻeleʻele maʻamau, nā paipu a me nā paipu pipette a me nā mea palekana kūpono, a hoʻomaʻemaʻe i ka wahi hana ma mua o ka hoʻomakaʻana i ka hana.
Hoʻomaopopo mau i nā hāʻina o ka mana, me ka DNAʻole a me kaʻole o ka enzyme, e hōʻoiaʻiʻo i ka hopena o ka'ōpili kūpono.
Makemake ka hapanui o ka poʻe e loaʻa i kā lākou mau hōʻoia pono'īʻole i hoʻokaʻawaleʻia no ka maʻalahi o ka weheweheʻana a ua kohoʻia nā pipettes i kahi PCR wale nō. ʻO ka DNase a me ka RNase-ʻole PCR tubes, nā papa pipili ārosol-resistant a me ka hanaʻana i loko o ka lumi kī i kaʻike Uila he mau ala like nō ia e hōʻemi i nā pilikia.
02 Na mea kanu
- E hoʻolālā he 18 a 24
- ʻAʻohe lua kūlana (ie, hairpin loops)
- E hoʻopili pololei i ka G / C a me nā hui A / T
- ʻAʻole kōkua kekahi i kekahi ma ka hopena 3-kapuai
- E hoʻolālā i nā anuanu (Tm) e pili ana i 5-10 kapuaʻi Celcius ma lalo o ka mahana hoʻonui, kahi maʻamau i 55 a 65 mau Celcius
E like pū ka Tm no nā lālaniʻelua no ka hopena maikaʻi loa.
03 Hoʻoponopono Hui: Template a me nā Primers
ʻO ka hoʻohālikelike kūpono mua ma waena 0.1 a me 0.6 micromoles / L. ʻO ka nui o keʻano hoʻopili e like me kaʻano o ke DNA (ke kanaka, ka bacteria, plasmid).
Me nā haʻawina nui loa o ka hoʻoponopono, aia kekahi mau kumu'ē aʻe e hoʻonui ai i nā hopena, e like me ka hoʻonuiʻia o nā helu a hoʻohana paha o ka "hoʻomaka wela." E ho'āʻo mau i nā'ōkuhi hou me kahi hopena maikaʻi maikaʻi, eʻike e hana lākou ma lalo o kāu mau hoʻokolohua hoʻokolohua.
04 Hui Hoʻohui: Haʻawina Enzyme
Hiki i ka hoʻomohalaʻana i ka MgCl2 i loko o ka hopena hui ke hoʻololi i ka hopena o ka PCR a hiki iā ia ke hoʻokani i kahiʻano nui i nā hopena wikiwiki aʻe. ʻO nā māmā magnesium c complex complexes me nā dNTPs e hana i ka mea paʻa maoli iʻikeʻia e ka enzyme polymerase.
Hoʻohālikeʻia nā pae'awaʻahāʻehā a pau e kōkua i ke emiʻana i ka hala hapa hala. Hiki i kekahi mau mea e like me ka betaine, BSA, nā mea maʻamau, DMSO, glycerol, a me pyrophosphatase ke hoʻololi pū paha i ka pono o ka enzyme.
05 Keʻano o Thermocycler
I ka kūʻaiʻana no nā mea hana i ka leka uila, e hoʻomanaʻo i kekahi mau mea hoʻohenee iki ma mua o nā mea'ē aʻe i ka mālamaʻana i nā kūpono, nā mahana i makemakeʻia.
ʻO kēia kahi kahi e hele ana i ka mea kūʻaiʻole e uku i ka wā lōʻihi keʻikeʻoe i ka hopena kīʻaha a hoʻohana paha i nā'ōmumu e makemake ana i kahi āiki o ka mahana wela.
ʻO nā kinikini i hoʻopaʻaʻia no ka hoʻopiliʻana i ka pono pono o ka thermocycler e hoʻohana neiʻoe, e kōkua pū i ke kohoʻana i nā mahanahana hoʻonā.
06 Hoʻonohonoho Papa
Hiki ke hoʻonuiʻia nā hopena ma o ka hoʻonuiʻana i ka manawa hoʻolālā e pili ana i nā 20 mau wiki, e uku no ka liʻiliʻi o ka enzyme e hoʻonui i keʻano hou. ʻO kaʻoihana, emi o nā kaha he 40 a hiki i ka hōʻemiʻana i kahi mau mea likeʻole ma lalo o 10 mau'ōmene liʻiliʻi i kahi ka nui i hiki ke nānā i kahi gel agarose .