He aha ka PCR e hana ai me ka DNA Sequencing a me nā hōʻailona hoʻokupu
ʻO kaʻaeʻana o ka polymerase ( PCR ) he mea iʻikeʻia no ka hanaʻana i nā kope he nui o ka'āpana a he pūhele hoʻi ia no ke kaʻina hana hukiʻi.
Pehea e Hana ai ke Kinohi Pahuhi Hua'ōlelo?
Hoʻokumuʻia nā kope kope e hoʻohana ana i kahi hōʻailona o DNA, a ua lawa kaʻenehana no ka hanaʻana i nā kope he nui mai kahi kope hoʻokahi o ka moʻo i loaʻa ma ka'ōpana. Paipai PCR o kahi moʻo e hana miliona miliona, eʻae ai no kaʻike a me kaʻikeʻana i nā pūnaewele pūnaewele e hoʻohana ana i nāʻikeʻike kiʻi e pili ana i ka nui a me ke kāohi (+ a -) o ka'āpana DNA.
Ma lalo o nā kūlana i mālamaʻia, ua hanaʻia nā'āpana liʻiliʻi o DNA e nā enzymes i kapaʻiaʻo DNA polymerases, e hoʻonui i nā deoxynucleotides (dNTPs) i kahi'āpana DNA i kapaʻiaʻo "template." ʻO nā'āpana liʻiliʻi o DNA, i kapaʻia he "primers" i hoʻohanaʻia i mea hoʻomaka no ka polymerase. ʻO nā Primers he mau'āpana DNA (oligomers) i hanaʻia e ke kanaka, i waena o 15 a 30 mau nucleotides lōʻihi. Hoʻomaopopoʻia lākou ma kaʻike a me ke kohoʻana i nā liʻiliʻi DNA liʻiliʻi ma nā hopena o ke gene e hoʻonuiʻia. I loko o ka PCR, e hoʻonāukiukiʻia ka DNA a hoʻokaʻawaleʻia ke kaula. Ma ka hoʻomahaʻana, hoʻokomoʻia nā pona i ka hōʻailona (i kapaʻiaʻo annealing) a hana i wahi no ka hoʻomakaʻana o ka polymerase.
ʻO ka PCR Technique
Ua hiki keʻaeʻana i ka'āpana o nāʻano polymerase (PCR) ma o kaʻikeʻana o nā thermophiles a me nā enzymes polymerase (thermophilic polymerase enzymes) (nā mau enzymes e mālama i ka pono kūpono a me ka hana ma hope o ka hoʻomehanaʻana i nā mahana wela).
ʻO nā kūpili i komo i loko o ka hana PCR penei:
- Hoʻokumuʻia kekahi kaʻina, me nā hoʻohālikelike kūpono o ka hōʻailona DNA, polymerase enzyme, primers, a me dNTPs. ʻO ka hiki i ka puhiʻana i ka pāpī me ka hōʻoleʻole i ka enzyme eʻae ai i ka hōʻikeʻana o ka helix lua o ke DNA o nā hiʻohiʻona i nā mahana ma ka laulā 94 hekeli Celsius.
- Ma hope o ka hōʻinoʻana, hoʻomahaʻia ka hōʻailona i kahi iʻoi aku ke kikowaena, ma kahi o 54 mauʻanuʻu, hiki ke kōkua i ka hoʻopaʻa (hoʻopaʻa) o nā kumu i nā hoʻopili DNA hoʻokahi.
- I ka mākaukauʻekolu o ka'ōlohelohe, ua hoʻonuiʻia ka hoʻolālā i 72 mau kekelina,ʻo ka mahana kūpono no ka DNA Polymerase Taq, no ka lōʻihi. I ka manawa o ka hoʻopauʻana, hoʻohana ka DNA polymerase i kaʻokoʻa mua o DNA ma keʻano he template e hoʻonui i nā dNTP mākaukau i nā '3' hopena o kēlā me kēia pilala a hana i kahi mahele o ka DNA pālua-lua ma ka'āpana o ka pulina.
- ʻO nā mea mua i hoʻopaʻaʻia i nā DNA i nā kikowaena i kūlikeʻole i ka hoʻohālikelikeʻana,ʻaʻole i hoʻomauʻia i 72 mau hiʻona, pēlā e hōʻemi ai i ka hoʻopiliʻana i ka hapanui waiwai.
Hoʻonui pinepineʻia kēiaʻano o ka hōʻailona, hoʻohui a me ka hoʻolimaʻiaʻana i nā manawa (30-40), a laila e hoʻonui i ka helu i nā kope o ka pū i makemakeʻia i loko o ka hui. ʻOiai e hana maʻalahi kēia hana inā hanaʻia me ka lima, hiki ke hoʻomākaukau a hoʻomohuʻia nā hōʻailona i kahi Thermocycler programma, i kēia manawa i ka hapanui o nā labo-leukula, a hiki ke hanaʻia ka hoʻopihapiha PCR piha i loko o nā hola he 3-4.
Ke hoʻopau kēlā me kēia hana i ke kaʻina hana o ka holomua o ka'ōlohemu mua, no laila e ho'āʻo ana i ka māhele hou o DNA a mālamaʻia i ka nui o ka pūnaewele i makemakeʻia.
Hiki ke lōʻihi o ka lōʻihi o ka hoʻolālāʻana o ke kelepona a iʻole ka pōkole ma muli o ka nui o ka pulina o ka hoihoi, akā ma ka hopena, ma o ka holoʻana o ka PCR,ʻo ka hapa nui o nā mamana e hoʻohālikelikeʻia me ka nui o ka'ōiwi wale nō, e hanaʻia paha mai nā huahana o nā kumu muaʻelua.
Nui nāʻano likeʻole no ka PCR holomua e hiki ke hoʻolālāʻia e hoʻoikaika i nā hopena. ʻO ka hoʻohana i hoʻohanaʻia i ka hoʻohanaʻana i ka huahana PCR he agarose gel electrophoresis . E hoʻohanaʻia ana e hoʻokaʻawale i nā'āpana DNA e pili ana i ka nui a me ka uku. Eʻikeʻia nā'āpana i nā meaʻono a iʻole radioisotopes.
ʻO ke Evolution
Mai ka loaʻaʻana o ka PCR, uaʻikeʻia nā DNme polymerases'ē aʻe ma mua aʻe o ka original Taq. ʻO kekahi o kēia mauʻoihana uaʻoi aʻe kaʻoi o ka "hōʻoia"ʻana a ua kūpaʻa paha i nā mahana kiʻekiʻe, pēlā e hoʻonui ai i ka hilinaʻi o PCR me ka hōʻemiʻana i nā hewa mai ka hoʻokomoʻana o ka dNTP kuhi.
Ua hoʻolālāʻia kekahi mauʻano likeʻole o ka PCR no nā noi kūikawā a ua hoʻohanaʻia i nā manawa a pau i nā laboratories. ʻO kekahi o kēia mau mea he PCR Real-Time PC a me Reverse-Transcriptase PCR. ʻO ka loaʻaʻana o ka PCR ka mea i alakaʻi i ke kākoʻoʻana o ka DNA sequencing, ke kaha lima lima o DNA a me nāʻano o nā mea lepe.